¿Qué es CRISPR y cómo funciona?
En biotecnología vegetal, CRISPR ha transformado la forma en que se estudian y modifican los genes [1]. Su capacidad para realizar cambios precisos en el ADN ha permitido acelerar el desarrollo de cultivos con características de interés agronómico y ha ampliado las herramientas disponibles para comprender la función de los genes y mejorar especies vegetales de manera más eficiente que con las metodologías tradicionales. Sin embargo, para comprender cómo funciona esta tecnología es necesario conocer los componentes que integran el complejo CRISPR/Cas9 y la forma en que interactúan con el ADN.
La primera pregunta que puede surgir al escuchar la palabra “CRISPR” es ¿qué significa? A decir verdad, el término es un acrónimo de la expresión en inglés “Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats“, que en español se traduce como “Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente Interespaciadas”. Esta expresión no dice demasiado sobre el uso de CRISPR como “tecnología” sino que se refiere a su funcionamiento primigenio.
Originalmente, el sistema CRISPR-Cas se encuentra presente en bacterias y arqueas, donde actúa como un mecanismo de defensa frente a virus y otros elementos genéticos invasores [2]. Aunque este sistema comenzó a descubrirse en 1987 [3], a partir de 2012 comenzó a adaptarse como herramienta de edición génica [4].
En este sentido, el término CRISPR se usa generalmente para referirse al complejo CRISPR/Cas9, siendo Cas9 la enzima endonucleasa “canónica” que, guiada por una molécula de ARN (el ARN guía o gRNA), corta el ADN en un sitio específico, lo que permite modificar una secuencia génica de manera precisa.
Todos estos elementos -la endonucleasa, el gRNA y el sitio blanco de la edición- poseen ciertas características que son necesarias para el funcionamiento del sistema CRISPR.
La endonucleasa
Cas9 solo tiene actividad nucleasa si está fusionada a un gRNA con complementariedad a una secuencia blanco en el ADN, y si en este ADN existe una secuencia PAM inmediatamente posterior (aguas abajo en sentido 3´) del sitio “indicado” por el gRNA. La endonucleasa más “estándar” es SpCas9, donde “Sp” señala que esta variante proviene de la bacteria Streptococcus pyogenes.
La actividad de Cas9 está dada por sus seis dominios. REC I y REC II estabilizan la unión de Cas9 al gRNA. El puente hélice rica en arginina (Bridge helix) es una hélice cargada positivamente que ayuda a iniciar la actividad nucleasa. El dominio PAM-interacting (PI) permite el reconocimiento y unión al sitio PAM, y HNH y RuvC son los dominios nucleasas que cortan una y otra cadena del ADN. Al unirse al ADN, la enzima sufre un cambio conformacional que ubica a estos dominios nucleasa en posición para cortar las dos cadenas del ADN en el sitio blanco. Esto produce una ruptura de la doble cadena (o DSB, por sus siglas en inglés “double strand break”), aproximadamente 3-4 nucleótidos aguas arriba de la secuencia PAM [5].
El gRNA
El vocablo gRNA deriva de la expresión en inglés “guide RNA”. Pero este elemento del complejo CRISPR también puede encontrarse en la literatura como sgRNA o “single guide RNA”.
El tipo de gRNA utilizado actualmente en edición génica es una derivación de los dos componentes de RNA propios del sistema CRISPR (Tipo II) nativo: un crRNA que guía a Cas9 a un target específico y un tracrRNA que permite el andamiaje con la endonucleasa. El gRNA adaptado para edición génica condensa ambos ARNs en una sola molécula y se compone de una secuencia “spacer” de ~20 nucleótidos que dirigen a Cas9 a un locus genómico específico, inmediatamente seguida de una secuencia de andamiaje o “scaffold” de ~76 nucleótidos para la formación del complejo con la enzima. La expresión coloquial “diseño del guía” se refiere a la selección, por parte del investigador, de una determinada secuencia de 20 nucleótidos que pueda encontrar complementariedad con la secuencia target de ADN que se quiere editar (siempre que haya una secuencia PAM presente), pero la secuencia andamiaje no se modifica ni se elige, sino que depende de la endonucleasa utilizada (SpCas9 o variantes) [6]. La seed sequence es una región corta del sgRNA en CRISPR-Cas9 que es clave para reconocer el ADN diana. Se ubica cerca del sitio PAM y es la primera parte que debe aparearse correctamente con la secuencia del ADN objetivo. Si esta coincidencia es perfecta, el complejo Cas9 se estabiliza y puede realizar el corte.
El sitio blanco
La secuencia objetivo debe ser única dentro del genoma para evitar cortes no deseados en otras partes del ADN (off-targets) y debe poseer un sitio PAM que pueda ser reconocido y unido por Cas9. El término PAM es un acrónimo que proviene del inglés “protospacer adjacent motif” (motivo adyacente de protoespaciador) y se refiere a una secuencia específica de nucleótidos que se encuentra inmediatamente después de la secuencia blanco a la que está dirigida Cas9. La secuencia PAM canónica de Cas9 es 5′-NGG-3′, donde “N” es cualquier nucleótido seguido de dos guaninas (“G”).
El sitio objetivo debe estar accesible para la Cas9. Esto significa que no debe estar rodeado por estructuras de cromatina cerrada o nucleosomas que impidan la unión de la proteína Cas9 al ADN. Los sitios en regiones abiertas o menos compactadas del ADN tienen más probabilidades de ser accesibles para la edición.
Pero… ¿qué relación hay entre cortar una secuencia de ADN y lograr editarla? ¿De qué modo la inducción de un DSB provoca una modificación en un determinado gen?
Como se describió previamente, Cas9 puede ser “programada” para realizar un DSB en el lugar que el investigador elija, pero este corte representa un daño al ADN que será inmediatamente reparado por los mecanismos propios de la célula: NHEJ(Non-Homologous End Joining) y HDR (Homology Direct Repair).
Ilustración de la ribonucleasa Cas9/sgRNA. La nucleasa Cas9 puede dividirse en dos partes según su estructura y función. La región de reconocimiento interactúa con el sgRNA y el ADN diana, mientras que la región nucleasa contiene dos dominios nucleasa (HNH y RuvC) y un dominio de interacción con la secuencia PAM. El sgRNA se genera mediante la unión del gRNA spacer y el gRNA scaffold mediante un tetrabucle artificial (nucleótidos en minúscula). La información de reconocimiento de la secuencia objetivo se encuentra almacenada en el extremo 5′ del sgRNA (en azul). La seed sequence (subrayada en rosa) del sgRNA es fundamental para la especificidad de Cas9. Cas9 y el sgRNA forman un complejo ribonucleoproteico capaz de unirse a la cadena complementaria del sitio objetivo y generar una rotura de doble cadena del ADN (DSB, double-strand break) tres nucleótidos aguas arriba de la secuencia PAM. Fuente: Ma et al., 2016, Molecular Plant (CC BY / Elsevier). DOI: https://doi.org/10.1016/j.molp.2016.04.009