La edición génica mediada por CRISPR permite modificar con alta precisión la secuencia de ADN de un organismo mediante la inserción, eliminación o sustitución de nucleótidos específicos. Sin embargo, la versatilidad de CRISPR ha permitido extender su uso hacia aplicaciones en las que se regula la actividad de los genes sin alterar el genoma.
En estos casos, el sistema se dirige a regiones específicas del ADN sin generar cortes ni cambios en la secuencia, modulando la expresión génica de manera controlada. Por este motivo, estas estrategias no se consideran edición génica en sentido estricto, sino enfoques de regulación de la expresión.
La base de estas aplicaciones es la proteína dCas9 (dead Cas9), una variante catalíticamente inactiva de Cas9 generada mediante mutaciones en sus dominios nucleasa HNH y RuvC. Aunque no puede cortar el ADN, conserva la capacidad de ser dirigida por un ARN guía hacia secuencias específicas del genoma. Al fusionarse con distintos dominios funcionales, permite activar o reprimir genes, así como modificar el estado epigenético de regiones concretas.
El principal uso de estas tecnologías es la investigación funcional de genes y redes regulatorias. La activación o represión reversible de genes permite analizar su función, mapear circuitos de regulación y comprender los mecanismos moleculares que controlan procesos como el desarrollo, la fisiología y la respuesta a estímulos ambientales.
CRISPRa (CRISPR activation)
Los sistemas CRISPRa consisten en la fusión de dCas9 con dominios activadores de la transcripción. Guiados por un ARN guía, estos complejos se dirigen a promotores o elementos reguladores (enhancers) para aumentar la expresión de genes diana sin modificar la secuencia de ADN.
Entre los activadores más utilizados se encuentra VP64, compuesto por cuatro copias del dominio activador viral VP16 del herpes simple. Otro sistema ampliamente empleado es VPR, un activador más potente formado por la combinación de VP64, p65 y Rta, capaz de reclutar eficientemente la maquinaria transcripcional.
En plantas, además de estos activadores de origen viral o animal, se han desarrollado sistemas optimizados como EDLL o constructos híbridos basados en dominios vegetales, que mejoran la eficiencia de activación en especies vegetales.
En conjunto, estos sistemas promueven el reclutamiento de la ARN polimerasa II y de factores de transcripción hacia el promotor, incrementando la iniciación de la transcripción de genes endógenos.
CRISPRi (CRISPR interference)
CRISPRi es una estrategia de represión transcripcional que utiliza dCas9 guiada por ARN para unirse a regiones regulatorias del gen, bloqueando físicamente la maquinaria transcripcional. Esto puede interferir con la unión de la ARN polimerasa, el reclutamiento de factores de transcripción o la elongación del ARN mensajero, reduciendo la expresión génica.
La versión básica utiliza únicamente dCas9 y ARN guía, pero existen variantes más potentes mediante la fusión de dominios represores. El más utilizado es KRAB, que induce la formación de cromatina represiva. De forma más reciente, el sistema KRAB–MeCP2 ha demostrado una represión más robusta y estable.
CRISPR como editor epigenómico
El epigenoma se define como el conjunto de marcas químicas sobre el ADN y las histonas que regulan la actividad génica sin modificar la secuencia de nucleótidos. Estas marcas desempeñan un papel central en el control de la expresión génica.
La regulación epigenómica incluye procesos como la metilación del ADN, las modificaciones de histonas, la organización de la cromatina y las interacciones con ARN y proteínas reguladoras. En conjunto, estos mecanismos determinan la accesibilidad del ADN y condicionan la actividad de los genes.
Las herramientas de edición epigenética basadas en CRISPR utilizan dCas9 como plataforma de direccionamiento para reclutar enzimas efectoras hacia loci específicos. Una vez allí, estas enzimas modifican el estado epigenético local, lo que puede activar o reprimir la expresión génica sin alterar la secuencia del ADN.
Entre los efectores más utilizados se encuentran las histona acetiltransferasas (HATs), histona metiltransferasas (HMTs), ADN metiltransferasas (DNMTs), desmetilasas y dioxigenasas de la familia TET, responsables de la oxidación de la 5-metilcitosina y procesos de desmetilación del ADN.
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