La edición génica mediada por HDR tiene la dificultad de requerir un RT (repair template) en el tiempo y lugar preciso. Por eso, se han desarrollado variantes de Cas9 que permiten aminorar esta dificultad. Estas estrategias permiten hacer cambios dirigidos sin inducir DSB ni requerir un RT. Al no generarse DSB, se reduce la posibilidad de NHEJ. Para funcionar se basan en el uso de la variante nCas9.
La enzima nCas9 (D10A) es una variante nicasa donde la mutación D10A afecta el dominio nucleasa RuvC. El cambio de Aspartato (D)10 a Alanina (A) inactiva la capacidad de Cas9 de realizar DSB y solo puede hacer un “nick”, es decir, cortar una sola hebra en el ADN. Combinada con una DNA deaminasa, se utilizada en edición de base (base editing o BE). La tecnología BE se utiliza para realizar pequeños cambios, de una o muy pocas bases. Incluye editores de bases de citosina (CBEs) que convierten la citosina en uracilo (lo que resulta en sustituciones de C por T, pirimidinas) y editores de bases de adenina (ABEs) que transforman la adenina en inosina (lo que resulta en conversiones de A por G, purinas). Los Glycosylase Base Editors (GBE) son una variante de los editores de bases citosina que incorporan una glucosilasa para generar sitios abásicos y redirigir la reparación del ADN. Esto permite obtener conversiones C→G y C→A, ampliando el espectro de ediciones posibles más allá de la conversión C→T característica de los editores de citosina convencionales.
Otra variante de Cas9 es la nicasa nCas9 (H840A) donde la mutación inactiva al dominio nucleasa HNH. Combinada con un gRNA “especial” llamado pegRNA (por prime editing gRNA) y una transcriptasa reversa permite insertar secuencias especificas en el ADN de forma muy precisa. En este caso, el pegRNA dirige a Cas9 a determinado sitio, pero también lleva consigo un molde de ARN que sirve de RT. Así, el RT es dirigido al sitio donde ocurre el “nick” y la transcriptasa reversa se encarga de insertar la nueva secuencia genética en el ADN basándose en el molde de ARN.
